Este es el primer capítulo de una miniserie llamada “USP tips” los cuales te van a ayudar a entender mejor los conceptos presentados en capítulos relacionados con análisis microbiológicos en la industria farmacéutica. Esta información la puedes encontrar en el capítulo <85> en dónde se describen todos los lineamientos para montar las pruebas de endotoxinas principalmente por la metodología de Gel Clot.
En este primer capítulo vamos a abordar un concepto clave para los análisis de endotoxinas elaborado por cualquier metodología (Gel Clot y método cinético cromogénico y turbidimétrico). La máxima dilución válida (MDV) es un valor que nos va a ayudar a poder montar con mayor facilidad nuestras muestras, puesto que en un ensayo de endotoxinas todas las muestras que se deseen montar van a tener que estar en estado sólido o en resuspención en una matriz certificada libre de endotoxinas.
¿Qué es la máxima dilución válida? Como las mismas palabras es la máxima dilución que uno puede realizar a la muestra para que en función de la sensibilidad del reactivo de LAL implementado, aún se pueda realizar la detección de alguna potencial carga de endotoxinas.
¿Qué pasa si excedo el valor de la MDV?
Si se sobrepasa el valor de la MDV óptima para nuestra muestra, es posible que no pueda detectar satisfactoriamente endotoxinas presentes en la muestra cuando se monte el ensayo. Para poder entender este escenario mejor, hay que tener en cuenta que uno de los implementos necesarios para desarrollar la prueba de endotoxinas es el reactivo de LAL, el cual tiene una característica muy especial y es la sensibilidad. Cuando nosotros hablamos de sensibilidad, nos estamos refiriendo en este caso específicamente a un rango de detección del reactivo (un máximo y un mínimo o un límite inferior o un límite superior)
Si nos excedemos en la MDV existen varias posibilidades, la primera es que si la cantidad de endotoxina no está cercano a nuestro límite inferior probablemente vamos a seguir obtenidos resultados normales o se va a seguir detectando la endotoxina. Sin embargo, el problema surge cuando las cantidades de endotoxina se acercan al límite inferior de detección de nuestro reactivo, en este caso vamos a generar un falso negativo pues gracias a la dilución excedida nuestro reactivo no va a ser capaz de detectar las endotoxinas presentes en la muestra.
Aclaración: En la USP la sensibilidad del reactivo de LAL la nombran como “lambda” (ʎ)
¿Cómo puedo calcular la MDV?
Para poder obtener la MDV se hace mediante un pequeño cálculo utilizado una ecuación descrita en el capítulo <85> de la USP, la cual relaciona el límite de endotoxinas, la concentración de nuestra muestra y la sensibilidad de nuestro reactivo.
Aclaración: Existen dos opciones posibles para poder utilizar esta ecuación.
- Si se tiene el límite de endotoxinas en las unidades (UE/mL) se está en capacidad de omitir la multiplicación por la concentración de la muestra. Realizándose únicamente la división entre el límite de endotoxinas y la sensibilidad de nuestro reactivo de LAL.
- Si las unidades de nuestro límite de endotoxinas son diferentes a (UE/mL) se realiza la ecuación tomando en cuenta todos sus componentes.
¿Qué valores se consideran “normales”?
No existen valores normales de MDV puesto que cada valor estará determinado por la muestra y el campo de aplicación del producto. Por ejemplo, no es lo mismo realizar pruebas en muestras de tejidos celulares que van a ser aplicados a neonatos en terapia celular a un producto veterinario aplicado a caballos; En el caso anterior los valores van a ser totalmente diferentes y variaran dependiendo matemáticamente del límite de endotoxinas
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