Kenneth D. Berthelette, Jennifer M. Nguyen, Kim Haynes, Amit Patel
La adsorción de metales puede ser un problemaen cromatografía líquida, especialmente en el caso de muestras altamente ácidas, como los péptidos fosforilados, o moléculas pequeñas, como los nucleótidos. Estas muestras pueden interactuar con las superficies metálicas, dando lugar a una forma fea de los picos, a una reducción del área o incluso a una pérdida total de la recuperación.1 Este problema puede mitigarse mediante la aplicación de la tecnología MaxPeak High Performance Surfaces (HPS), que se ha aplicado a las columnas y sistemas de Waters. Aquí demostramos el uso de las columnas MaxPeak Premier en tres sistemas diferentes que no son Waters para el análisis de un analito sensible a los metales, la adenosina 5′-(α,β-metileno) difosfato (AMPcP). Esta muestra ha mostrado una fuerte sensibilidad a los metales y es más estable que compuestos como el trifosfato de adenosina o el difosfato de adenosina.2 Nuestros resultados muestran que, independientemente del sistema de cromatografía utilizado, una columna MaxPeak Premier produce mayores áreas de pico y, por tanto, una mayor recuperación de analitos para el AMPcP en comparación con las columnas de acero inoxidable. Esto indica que las ventajas de las columnas MaxPeak Premier son independientes del sistema y resultan beneficiosas para casi todas las configuraciones.
Beneficios
■ Aumento del área de pico, o de la recuperación, para el AMPcP utilizando las columnas MaxPeak Premier
■ Caracterización del grado de interacción de los metales utilizando un estándar de AMPcP/Adenosina en varios sistemas de cromatografía líquida.
■ Ventajas de la recuperación en función del sistema para los analitos sensibles a los metales
Introducción
Las superficies metálicas de un sistema de cromatografía, incluido el hardware de la columna, pueden interactuar con analitos ácidos a través de la atracción ácido-base de Lewis, lo que puede dar lugar a una forma de picos deficiente. Este efecto puede minimizarse utilizando fases móviles de pH alto, ya que las superficies metálicas están cargadas positivamente en entornos de pH neutro y ácido. Sin embargo, incluso con un pH alto este efecto puede seguir siendo problemático. Para combatirlo, las superficies de alto rendimiento MaxPeak (HPS) se han aplicado a muchas de las químicas de columna ofrecidas por Waters, así como a algunos sistemas de LC, incluido el sistema ACQUITY Premier. Al utilizar una columna MaxPeak Premier en el sistema ACQUITY Premier, se minimizan las interacciones metálicas, lo que permite una alta recuperación y una buena forma de los picos de las muestras ácidas. 1,3-5 Aunque las columnas MaxPeak Premier proporcionan un excelente performance cuando se combinan con un sistema ACQUITY Premier,también pueden utilizarse en cualquier sistema de LC para mejorar la recuperación de las muestras ácidas.
Se evaluaron un Agilent 1290 Infinity I, un Shimadzu Nexera-I LC2040 y un sistema Thermo Vanquish UHPLC utilizando un estándar que contenía concentraciones equimolares de AMPcP y adenosina para investigar las interacciones metálicas de los tres sistemas LC. El AMPcP, un compuesto con dos grupos fosfato, es sensible a las superficies metálicas pero no es hidrolizable y, por tanto, es más estable que una muestra de nucleótidos. La adenosina es un compuesto estructuralmente similar pero sin los grupos fosfato, lo que permite una respuesta UV similar, pero sin posibles interacciones con los metales. A partir de este estudio, la columna XSelect Premier HSS T3 produjo las recuperación más alta independientemente del sistema utilizado, donde en un caso, la recuperación fué >50% mucho mejor que enlas columnas convencionales probadas.
Condiciones experimentales
Descripción de la muestra: El estándar de AMPcP y adenosina de Waters (P/N: 186009755 ) se reconstituyó en 200 µl de agua. El vial se agitó durante 10 segundos antes de la inyección. Se creó una muestra fresca del mismo lote antes del análisis en cada sistema.
Condiciones del método:
Sistemas de LC: Agilent 1290 Infinity I; Thermo Vanquish UHPLC; Shimadzu Nexera-I 2040
Detección: UV @ 260 nm
Columna(s): Columna XSelect HSS T3 XP, 2,1 x 50 mm, 2,5 µm (PN: 186006149)
Columna XSelect Premier HSS T3, 2,1 x 50 mm 2,5 µm (PN: 186009830)
Columna Zorbax SB-Aq, 2,1 x 50 mm, 3,5 µm
Temperatura de la columna: 40 °C
Volumen de inyección: 1 µL (3 µL en Shimadzu Nexera-I)
Velocidad de flujo: 0,36 mL/min (0,70 mL/min en Shimadzu Nexera-I)
Fase móvil A: 10 mM de acetato de amonio, pH 6,8 en 99,8/0,2 de agua/acetonitrilo
Fase móvil B: acetato de amonio 8 mM pH 6,8 en 79,8/20,2 agua/acetonitrilo
Gradiente: Ver tabla
Gestión de datos: Software de cromatografía: Empower 3; Feature Release 5 (sistemas Agilent y Shimadzu) o Chromeleon versión 7.2 (Thermo System)
Resultados y discusión
La AMPcP se emplea como estándar de control de calidad para caracterizar el alcance de las interacciones metálicas en sistemas con y sin MaxPeak HPS.2 En combinación con un compuesto estructuralmente similar, pero no reactivo, como la adenosina, pueden compararse las áreas de pico de la AMPcP sensible a los metales y de las sondas insensibles. El estándar utilizado aquí emplea concentraciones equimolares de adenosina y AMPcP, lo que permite comparar directamente las áreas de los picos y calcular una relación de áreas de los picos, que puede utilizarse para evaluar las interacciones metálicas en un sistema. Por lo tanto, aplicamos esta norma para verificar que las ventajas de rendimiento de las columnas MaxPeak Premier son ajenas al sistema, evaluando sistemas de LC alternativos sin HPS. Para ello, las condiciones de LC documentadas para el estándar debían trasladarse a la configuración de la columna de prueba. El método se modificó utilizando la calculadora de columnas ACQUITY y aplicando las condiciones de análisis correctas a las nuevas columnas. Antes de la prueba, cada columna se equilibró a las condiciones iniciales durante 10 minutos y se realizó una inyección en blanco.
El primer sistema probado fue un Agilent 1290 Infinity I, equipado con una bomba cuaternaria y detección DAD. La figura 1 muestra el primer cromatograma del estándar de adenosina AMPcP en el sistema Agilent 1290.
Orden de elución: 1) AMPcP y 2) Adenosina. El cuadro es una parte ampliada del eje X con cromatogramas superpuestos para mostrar las diferencias de altura y forma de los picos de AMPcP en las tres columnas.
El pico de AMPcP es considerablemente mayor en la columna XSelect Premier HSS T3 en comparación con las otras dos columnas. Esto puede atribuirse directamente al hardware MaxPeak HPS de la columna, ya que la XSelect HSS T3 contiene la misma fase estacionaria pero un hardware de columna diferente. La columna Zorbax SB-Aq muestra una altura de pico ligeramente mayor en comparación con la XSelect HSS T3, pero no tan alta como la columna XSelect Premier HSS T3.
Además, como se muestra en la Tabla 1, las áreas de los picos de AMPcP son mayores en la columna XSelect Premier HSS T3.
La columna XSelect Premier HSS T3 produjo un área de pico promedio para AMPcP >50% mayor que las otras columnas probadas. Mientras tanto, las áreas de pico para la adenosina son consistentes en las tres columnas probadas. La disminución del área de pico para AMPcP en las columnas de acero inoxidable puede atribuirse directamente a la pérdida de analito debido a la interacción con el metal. Las dos columnas de acero inoxidable tuvieron un comportamiento similar, con relaciones de área de pico de 0,34 y 0,35, mientras que la columna XSelect Premier HSS T3 dio una relación de área de pico de 0,54. La mayor relación de área de pico indica diferentes niveles de adsorción de metales para cada columna. Cuanto mayor sea la relación de área de pico, menor será la adsorción detectada.
A continuación se investigó una Shimadzu Nexera-I LC2040 configurada con una bomba cuaternaria y detección UV. Durante las pruebas iniciales, la retención de adenosina fue mayor de lo previsto y fue necesario cambiar el método. Esto puede atribuirse tanto a las diferencias de retardo del gradiente para el sistema, como a la configuración del mismo. El caudal se aumentó a 0,7 mL/min en el sistema Shimadzu. Además, debido a la baja señal UV para la adenosina y el AMPcP en este sistema, el volumen de inyección se aumentó a 3 µl. Conseguir una buena señal UV para ambas sondas es esencial para determinar las relaciones de área de los picos y evaluar las interacciones metálicas de las columnas. La figura 2 muestra la cromatografía conseguida en el Shimadzu Nexera-I utilizando las tres columnas.
A primera vista, las tres columnas tienen un rendimiento comparable con alturas de pico similares, aunque la columna XSelect Premier es ligeramente más alta, como se vio en el sistema Agilent. Esto podría deberse al mayor volumen de inyección del estándar en el sistema Shimadzu, necesario para alcanzar alturas de pico razonables. Se ha demostrado que a diferentes cargas de masa, es decir, la masa de analito inyectada en la columna, el efecto de adsorción es diferente.1,3,7 Aunque la diferencia entre las tres columnas es sutil en función de la cromatografía, sigue habiendo un aumento del área de pico cuando se utiliza la columna XSelect Premier HSS T3. La Tabla 2 muestra las áreas de pico promedio para las inyecciones replicadas del estándar en la Shimadzu Nexera-I.
La columna XSelect Premier HSS T3 produjo un área de pico promedio un 10% mayor que las otras dos columnas, y una relación de área de pico casi 0,2 unidades mayor. Esto indicaría que, aunque la cromatografía parece comparable entre las tres columnas, la columna XSelect Premier HSS T3 sigue proporcionando una ventaja en la recuperación de analitos.
El último sistema que se probó fue un Thermo Vanquish equipado con una bomba cuaternaria y detección UV. Se utilizó Chromeleon 7.2 para el control del software. La figura 3 muestra la cromatografía obtenida en el sistema Thermo Vanquish utilizando las tres columnas y el estándar de adenosina AMPcP.
En el sistema Thermo Vanquish, la columna XSelect Premier HSS T3 produjo un 20% más de áreas de pico que las otras dos columnas. La relación de áreas de pico también es mayor en la columna XSelect Premier HSS T3 en casi 0,2 unidades.
Conclusión
Se utilizaron tres sistemas de LC para probar en tres columnas diferentes el grado de interacción metálica presente. Para comprobar las interacciones metálicas se analizó una muestra sensible a los metales, (AMPcP), con una muestra insensible, la adenosina.
Cuando se analizan juntas, las áreas de los picos de las dos sondas pueden compararse obteniendo una relación de áreas de los picos. Esta relación es una medida de las posibles interacciones de los metales en el sistema. Las relaciones de área de pico más altas indican una menor interacción de los metales.
Las relaciones de área de pico obtenidas en este trabajo muestran que las columnas MaxPeak Premier pueden proporcionar una mayor recuperación de picos para una sonda ácida en comparación con las columnas de acero inoxidable. El uso de las columnas MaxPeak Premier puede ayudar a los analistas a detectar y cuantificar analitos ácidos independientemente del sistema de LC que se utilice, sin necesidad de agentes de pasivación o métodos de separación especializados. Esto permite una cuantificación más precisa y unos límites de detección potencialmente más bajos, ambos críticos para determinados ensayos.
Referencias
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