Introducción
Las técnicas cromatográficas (incluyendo la cromatografía líquida, de gases y de capa fina), se han utilizado durante décadas en los laboratorios clínicos especializados para la separación y semicuantificación de biomarcadores establecidos. En los últimos 20 años se ha producido una transición hacia la detección por espectrometría de masas (MS) en lugar de los métodos de detección convencionales. Dadas las características de alta selectividad y sensibilidad, no es sorprendente que esta la cromatografía líquida acoplada a la MS (LC-MS) se utilice cada vez más en el laboratorio clínico.
A pesar de una historia que abarca más de 40 años, los desafíos cromatográficos son comunes en el análisis de diagnóstico clínico, incluso con la selectividad mejorada que ofrece la detección por MS. La complejidad de las muestras procedentes de diversas poblaciones de pacientes puede hacer necesario más de un método cromatográfico para el análisis de un biomarcador objetivo que permita la medición en todos los subgrupos de pacientes y permita la realización de pruebas de confirmación cuando haya interferencias inusuales. Esta necesidad pone un gran énfasis en las opciones de fase estacionaria que exploran diferentes mecanismos de retención.
Análisis rápido y robusto a “bajas presiones”
Muchos de los análisis de que se realizan emplean métodos que utilizan instrumentación con límites de contrapresión de 5000 psi o menos, lo que se conoce como HPLC. Con estos límites de presión los tiempos de corrida resultan muy largos para algunos laboratorios en la actualidad, o son una barrera para el crecimiento, que con una tasa de expansión ≥10% año tras año, se convierte en un factor de riesgo para la existencia misma del laboratorio. Aunque una alternativa es la sustitución de la instrumentación por equipos de cromatografía líquida de ultra alta presión (UHPLC o UPLC), es cierto que la inversión en equipos que aprovechen las ventajas de las partículas sub-2-µm es una barrera a vencer.
Un avance importante en la tecnología de columnas fue la aparición de partículas de sílice superficialmente porosas (SPP) de más de 2 µm que pueden proporcionar una mayor eficiencia con un menor aumento de contrapresión que las observadas con las columnas de partículas totalmente porosas de menos de 2 µm. En los ensayos clínicos de HPLC, por ejemplo, las vitaminas A y E en suero y las catecolaminas, metanefrinas y ácido 5-hidroxiindolacético en orina, la introducción de SPP de permitió el uso de columnas más cortas para producir una separación cromatográfica muy similar con tiempos de ejecución muy reducidos y cambios mínimos en la contrapresión. En muchos casos, esto aumenta de 3 a 4 veces la capacidad de la instrumentación de HPLC existente. El tamaño de las partículas no es la única limitante para acelerar aún más la cromatografía, sino una combinación de otros factores, como la velocidad de funcionamiento del automuestreador, el volumen de la celda del detector y el límite de la tasa de recogida de datos del detector.
Se debe tener en cuenta que idealmente la reducción de los tiempos de entrega de las muestras de los pacientes no se produzca a expensas de la robustez del método, por lo que, en un laboratorio clínico, los requisitos de preparación de muestras deben cumplirse estrictamente en caso de ser necesarios.
Innovaciones en las fases estacionarias
Innovaciones en las fases estacionarias
El análisis LC-MS en química clínica ha proporcionado muchos beneficios; sin embargo, siguen existiendo retos relacionados con la separación cromatográfica de compuestos similares. Con el número de disolventes y aditivos limitado a los que se consideran “amigables con la MS” (es decir, volátiles, donadores de protones, o que aceptan, no forman fragmentos no deseados), la selección de la fase estacionaria ha adquirido mayor importancia. La cromatografía es necesaria no sólo para la eliminación de los interferentes que causan la supresión de iones, en particular las sales y los fosfolípidos presentes en la sangre y la orina, sino también para la separación de los compuestos isobáricos que comparten las transiciones de masa utilizadas para la cuantificación. Las fases estacionarias con enlaces alquílicos han sido el pilar tradicional de las separaciones clínicas por HPLC, con tampones de fase móvil y reactivos de pares de iones que proporcionan la selectividad adicional necesaria. A medida que los ensayos pasan a la LC-MS-MS, el énfasis se ha puesto en las fases estacionarias emergentes que utilizan mecanismos alternativos de retención para separar los pares críticos analito-interferencia.
Los problemas con las interferencias isobáricas en la LC-MS clínica pueden agravarse cuando los compuestos son extremadamente polares y difíciles de separar por la mayoría de las fases de cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC). La medición de los compuestos del ciclo de Krebs demuestra este escenario en el que es necesario resolver los pares críticos de isocitrato-citrato y succinato-ácido metilmalónico. La evolución y diversificación de las fases que incorporan un grupo polar embebido (EPG) con un ligando alquílico ha producido fases estacionarias con una amplia gama de propiedades cromatográficas que son capaces de operar en fases móviles 100% acuosas.
Máximo aprovechamiento de la instrumentación
Para los laboratorios pequeños o medianos, el flujo de trabajo de LC-MS consiste en numerosas aplicaciones en las que se ejecutan pequeños lotes de muestras de pacientes de forma regular (diaria o semanalmente). A menudo, estas aplicaciones dependen de diferentes fases móviles y estacionarias para lograr la selectividad cromatográfica requerida. Para aprovechar la capacidad de los instrumentos de LC-MS y lograr una rentabilidad favorable, los sistemas deben funcionar de forma continua con un proceso automatizado para cambiar de un método a otro sin intervención del personal.
Los sistemas HPLC que incorporan configuraciones que permiten ejecutar simultáneamente múltiples combinaciones de fase móvil y columna existen desde hace tiempo en los laboratorios de investigación y desarrollo de ensayos. Sin embargo, debido a problemas de fiabilidad, a la complejidad del software, a la preocupación por el servicio de asistencia técnica y a la falta de operadores experimentados en los propios laboratorios, estos instrumentos no se promocionaban regularmente en los laboratorios de diagnóstico clínico. Esta situación ha cambiado en los últimos años, al simplificar las configuraciones de instrumentos que se controlan fácilmente mediante el software.
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