La temperatura de separación es importante en HPLC, ya que puede influir en el tiempo de retención, la selectividad y la forma de los picos. Aunque este es uno de los factores clave que hay que controlar durante el desarrollo y la transferencia de los métodos de LC, la comprensión del termostato de la columna y el precalentamiento de la fase móvil y su impacto en la cromatografía suelen ser incompletos.
En una nota de aplicación realizada por Zhimin Li, Paula Hong y Patricia R. McConville de Waters Corporation se demostró el efecto del precalentamiento de la fase movil sobre la resolución, la selectividad, el desarrollo del método y la transferencia del mismo en un par crítico de compuestos sensibles a la temperatura.
En la cromatografía líquida es importante comprender el mecanismo y el impacto de la termorregulación del compartimento de la columna y el precalentamiento de la fase móvil en las separaciones cromatográficas.
La temperatura de separación desempeña un papel importante en la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), ya que puede influir en el tiempo de retención, la selectividad y la forma del pico. Si bien la temperatura es uno de los factores clave que hay que controlar durante el desarrollo y la transferencia de los métodos de LC, la comprensión del termostato de la columna y el precalentamiento de la fase móvil y su impacto en la cromatografía usualmente es muy limitado.
En el mercado actual la mayoría de los sistemas de LC tienen dos tipos comunes de compartimentos de columna, los de calentador de bloque y los de aire de circulación. Los diferentes mecanismos de termostato pueden dar lugar a diferentes mecanismos de termostatación, y esto puede dar lugar a diferencias en la eficiencia de la transferencia de calor, el equilibrio de la temperatura y la creación de un gradiente de temperatura en la columna.
Para un precalentamiento adecuado de la fase móvil, la mayoría de los proveedores de LC proporcionan precalentadores que calientan la fase móvil a la temperatura establecida para el método antes de introducir el disolvente en la columna. El precalentamiento de la fase móvil puede ser pasivo o activo. Los precalentadores pasivos son capilares de una longitud determinada que están en contacto sólido directo con una superficie de temperatura controlada en el compartimento de la columna. Los precalentadores activos emplean un elemento calefactor interno para controlar activamente la temperatura del eluyente. Todas estas variables pueden afectar las transferencias de masa en las separaciones sensibles a la temperatura. Para ilustrar esto, realizamos una separación sensible a la temperatura en el sistema ACQUITY Arc configurado con el ACQUITY Column Manager (CMA), una nueva extensión de los compartimentos de columna a la familia ACQUITY Arc y ACQUITY Arc Bio.
Para ilustrar como el precalentamiento influenciaba en el resultado, se llevó a cabo una separación de un par crítico desde una mezcla de analgésicos, (componente 6 (fenacina) y 7 (ácido salicílico)) en el sistema ACQUITY Arc configurado con el ACQUITY Column Manager (CMA).Condiciones: Columna, XBridge BEH C18 , 130 Å, 3.5 µm, 4.6 mm x 150 mm, Inyección:5 µL; Flujo:1 mL/min; Fm A: agua/0.1% Ácido fórmico; Fm B:Acetonitrilo/0.1% Ácido fórmico; Software:Empower FR3; Detector: Photodiode Array (PDA), 245 nm.
Como resultado, observamos la Figura 1. que compara la separación de la mezcla de analgésicos con el precalentador activado y desactivado en el sistema ACQUITY Arc. En la mezcla de muestras, la tendencia es que la separación del par crítico a una temperatura alta sin precalentamiento fue similar al perfil de separación a una temperatura baja con precalentamiento.((B) a 45 C vs (A) a 35 C), y aunque todos los picos se desplazan a tiempos de retención más cortos con el aumento de la temperatura, el grado de desplazamiento del tiempo de retención con el precalentamiento fue mayor que el desplazamiento del tiempo de retención sin precalentamiento.
Observamos en la figura 2 que con el precalentamiento la pendiente es mayor que la pendiente sin precalentamiento. Esto indica que la fase móvil de la columna analítica se ajusta a la temperatura establecida más rápidamente con el precalentamiento que sin él. Sin precalentamiento hay un desajuste entre la temperatura de la pared de la columna y el flujo de la fase móvil, creando un gradiente de temperatura a través de la columna. Entonces se pudo concluir que el precalentamiento de la fase móvil, afecta en gran medida a las separaciones sensibles a la temperatura. Se sugiere que al desarrollar y/o transferir métodos entre diferentes sistemas de LC, se utilice siempre un precalentador al desarrollar un nuevo método.
Más información en: Zhimin Li, Paula Hong, Patricia R. McConville, Waters Corporation; The Importance of Column Compartment Thermostatting and Preheating for Temperature Sensitive Separations in Liquid Chromatography; Tomado de: https://www.waters.com/webassets/cms/library/docs/720007137en.pdf
