Introducción

Los aminoglucósidos (AMG) son una clase importante de antibióticos que se han utilizado ampliamente tanto en medicina humana como veterinaria para tratar infecciones bacterianas por Gram negativas. El uso de AMG fuera de las indicaciones establecidas en la producción animal, como no respetar el tiempo de retiro después del tratamiento, puede generar niveles elevados de residuos de AMG en los alimentos. La presencia de AMG en los alimentos representa un riesgo para la salud del consumidor debido a su toxicidad, alergenicidad y posible contribución al desarrollo de resistencia a los antimicrobianos. Por ello, es importante monitorear el contenido de AMG en los alimentos para garantizar su uso adecuado y la seguridad alimentaria. Varios países y organizaciones internacionales han establecido límites máximos de residuos (LMR) para los AMG en alimentos de origen animal (consulte la Tabla 1).1–5

Los AMG son compuestos polares y solubles en agua. Los agentes de formación de pares iónicos se han utilizado con éxito en cromatografía líquida de fase reversa para el análisis de AMG.6,7 Sin embargo, debido a las dificultades prácticas asociadas con estos agentes, como los largos tiempos de equilibrado y sus posibles efectos perjudiciales sobre otras aplicaciones que no utilizan pares iónicos, este enfoque ha tenido una aplicación limitada.8

Como alternativa, los AMG pueden analizarse mediante cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC), aunque se observa una selectividad de separación limitada para estos compuestos cuando se utilizan fases estacionarias HILIC de tipo amida o aminopropilo.9 Se ha informado que las fases estacionarias zwitteriónicas presentan una mejor resolución para la separación de AMG en comparación con las columnas de amida o aminopropilo. Sin embargo, algunas columnas HILIC zwitteriónicas requieren concentraciones elevadas de tampón en la fase móvil, de hasta 175 mM, lo cual no es una condición preferible para el análisis mediante LC-MS.9

En este estudio, se evaluó la columna Atlantis Premier BEH Z-HILIC, que cuenta con una fase estacionaria zwitteriónica de sulfoalquilbetaína sobre partículas BEH, para el análisis de 17 AMG en alimentos mediante espectrometría de masas en tándem con ionización por electrospray (ESI-MS/MS). Los AMG incluidos en este estudio fueron: amikacina (AMI), apramicina (APR), gentamicina (GEN C1, C1a, C2/C2a), higromicina B (HYG), kanamicina (KAN), kasugamicina (KAS), neomicina (NEO), neamina (o neomicina A, NEO A), paromomicina (PAR), ribostamicina (RIB), espectinomicina (SPC), estreptomicina (STP), dihidroestreptomicina (DSTP), sisomicina (SIS) y tobramicina (TOB). Las estructuras de estos AMG se muestran en la Figura 1. Se evaluaron sistemáticamente los efectos de las condiciones cromatográficas sobre la separación y detección de los AMG. Se adaptó y optimizó un procedimiento de extracción en fase sólida y limpieza originalmente utilizado para STP, DSTP, GEN y NEO.10 El desempeño del método se evaluó utilizando muestras de leche, músculo, hígado y miel.

Tabla 1. LMR de AMG en alimentos de origen animal establecidos por diferentes países y organizaciones.

Figura 1. Estructuras de los AMG incluidos en este estudio. La gentamicina presenta 4 isómeros: C1, C1A, C2 y C2A.

Experimental

Todas las muestras de alimentos y los estándares de AMG se prepararon utilizando recipientes, materiales o elementos de laboratorio de polipropileno (PP) o plástico.

Productos químicos y soluciones

La amikacina, higromicina B, sulfato de ribostamicina, sulfato de sisomicina, sulfato de gentamicina, sal trisulfato hidratada de neomicina, sulfato de tobramicina y sulfato de kanamicina fueron adquiridos a Sigma-Aldrich (Allentown, PA).

El clorhidrato de neamina (o neomicina A), sulfato de apramicina, clorhidrato de kasugamicina, sulfato de estreptomicina, sulfato de paromomicina, sulfato de dihidroestreptomicina y dihidrocloruro hidratado de espectinomicina fueron adquiridos a Cayman Chemical (Ann Arbor, MI).

La GEN está compuesta por una mezcla de cuatro componentes: GEN C1, C1a, C2 y C2a. GEN C2 y C2a son estereoisómeros. Las estructuras de estos AMG se presentan en la Figura 1.

Se prepararon soluciones estándar madre de AMG (1 mg/mL) disolviendo los estándares en agua desionizada (>18,2 MΩ·cm). Las soluciones estándar de trabajo se prepararon mezclando y diluyendo las soluciones madre con agua desionizada. Todas las soluciones se almacenaron en recipientes de PP en un congelador (-20 °C). Se utilizó AMI como estándar interno (IS).

Se preparó una solución de extracción que contenía 10 mM de acetato de amonio, 0,4 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 0,5 % de NaCl y 2 % de ácido tricloroacético (TCA), de la siguiente manera:

Se colocaron 0,385 g de acetato de amonio en un matraz aforado de 500 mL. Se añadieron aproximadamente 450 mL de agua desionizada y se disolvió. Después de ajustar el pH a 4,0 con ácido fórmico (FA) reactivo, se añadieron al matraz 0,074 g de etilendiaminotetraacetato disódico dihidratado, 2,5 g de cloruro de sodio y 10 g de TCA. Se mezcló bien hasta disolver y se llevó hasta el volumen con agua desionizada.

Descripción de las muestras

Las muestras de leche, músculo (carne de res y cerdo), hígado (aves de corral) y miel se adquirieron en establecimientos comerciales locales. La miel se incluyó en este estudio debido a que las infecciones bacterianas de las abejas pueden tratarse con AMG.Las muestras de miel y leche se conservaron refrigeradas (0–4 °C), mientras que las muestras de músculo e hígado se conservaron congeladas (-20 °C).

Extracción y limpieza de las muestras

Se mezclaron 3 g de miel, leche, músculo molido o tejido hepático picado con 20 mL de solución de extracción en un tubo de centrifugación de PP de 50 mL. El tubo se sometió a vortex a alta velocidad (3200 RPM) durante 2 minutos y posteriormente se colocó en un refrigerador durante 30 minutos. La muestra se sometió nuevamente a vortex y luego se centrifugó a 3200 g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se transfirió cuantitativamente a otro tubo de centrifugación de PP de 50 mL utilizando una pipeta de transferencia de plástico. Mediante un medidor de pH calibrado, el sobrenadante se ajustó a un pH de 6,75 ± 0,25 utilizando soluciones básicas de KOH al 50 % y 10 %, antes de realizar la extracción en fase sólida (SPE) y la limpieza. El cartucho SPE Oasis HLB (cartucho Vac de 6 cc, 500 mg de sorbente, 60 µm; P/N 186000115) se acondicionó y equilibró con 3 mL de metanol y 3 mL de agua desionizada antes de cargar todo el sobrenadante (aproximadamente 18 mL). Después de la carga, el cartucho se enjuagó con 3 mL de agua desionizada y se secó durante 15 minutos bajo vacío. Los analitos se eluyeron con 3 mL de solución de elución (10 % v/v de FA y 5 % v/v de isopropanol en agua). El extracto final se analizó mediante LC-MS/MS sin necesidad de reconstitución ni dilución. En el procedimiento de limpieza mediante SPE se utilizaron tanto un colector de extracción Waters (Vacuum) Manifold (186008998) como un colector de presión positiva Otto SPEcialist (725000682), obteniéndose resultados comparables. También se obtuvieron resultados comparables utilizando el cartucho Oasis PRiME HLB (P/N 186008718), sin realizar las etapas de acondicionamiento y equilibrado.

Condiciones de LC

Sistema LC:
Arc Premier System con Binary Solvent Manager

Sistema MS:
Xevo TQ-S micro System

Tiempo de análisis:
10,0 minutos

Columna:
Atlantis Premier BEH Z-HILIC Column (2,5 µm, 2,1 × 150 mm, P/N: 186009987)

Temperatura:
50 °C

Fases móviles:
A: 20 mM de formiato de amonio en agua (pH 3,0)
B: 0,1 % de FA en acetonitrilo

Solvente de purga:
Mezcla de agua/acetonitrilo (1/9 v/v)

Volumen de inyección:
6,0 µL

Tabla de gradiente

Figura/tabla: Programa de gradiente utilizado en el método.

Condiciones de MS

Software:
MassLynx v4.2 SCN1017

Polaridad:
ES+

Temperatura de desolvatación:
600 °C

Voltaje del capilar:
1,5 kV

Flujo de gas del cono:
50 L/h

Temperatura de la fuente:
150 °C

Flujo de gas de desolvatación:
1000 L/h

Tabla 2. Transiciones MRM, parámetros del cono y parámetros de colisión utilizados en este estudio. Las trazas de cuantificación MRM se muestran en negrita.

Resultados y discusión

1. Separación de AMG en la columna Atlantis Premier BEH Z-HILIC

El contenido de fase móvil acuosa, el pH y la concentración del tampón son los principales factores para optimizar la separación de los AMG en las columnas Atlantis Premier BEH Z-HILIC.

1.1 Efectos del contenido acuoso de la fase móvil

La Figura 2 muestra los efectos del contenido acuoso de la fase móvil sobre los tiempos de retención (RT) de determinados AMG en una columna Atlantis Premier BEH Z-HILIC (2,1 × 100 mm, 1,7 µm) bajo condiciones de elución isocrática.

La fase móvil acuosa A fue formiato de amonio 20 mM a pH 3,0 y la fase móvil B fue acetonitrilo con 0,1 % de FA.

La Figura 2 muestra que, cuanto mayor es el contenido acuoso de la fase móvil, más rápida es la elución, es decir, menor es el tiempo de retención (RT).

Figura 2. Efectos del contenido acuoso de la fase móvil sobre los tiempos de retención de determinados AMG en una columna Atlantis Premier BEH Z-HILIC.

1.2 Efectos del pH de la fase móvil

La Figura 3 muestra los efectos del pH de la fase móvil A sobre los tiempos de retención de determinados AMG en una columna Atlantis Premier BEH Z-HILIC (2,1 × 100 mm, 1,7 µm) bajo condiciones de elución en gradiente, en las que la fase móvil A aumenta del 20 % al 95 % en 5 minutos y se mantiene al 95 % durante 10 minutos. La fase móvil A fue una solución acuosa de formiato de amonio 20 mM a diferentes valores de pH, mientras que la fase móvil B fue acetonitrilo con 0,1 % de FA. El flujo fue de 0,2 mL/minuto y la temperatura de la columna fue de 40 °C. La Figura 3 muestra que los AMG de elución tardía presentan una mayor dependencia del pH. En condiciones de pH elevado, los AMG, que son bases débiles, se encuentran menos ionizados y presentan interacciones hidrofóbicas más fuertes con la fase estacionaria, lo que genera mayores tiempos de retención. La forma de los picos, la intensidad de los picos y la resolución también se ven afectadas por el pH de la fase móvil. La Figura 4 muestra los cromatogramas de determinados AMG bajo las mismas condiciones utilizadas en la Figura 3. Al cambiar el pH de 9 a 3, los picos, especialmente los de elución tardía, se vuelven más estrechos, simétricos y de mayor intensidad, además de presentar una mejor resolución.

Figura 3. Efectos del pH sobre los tiempos de retención de determinados AMG en una columna Atlantis Premier BEH Z-HILIC.

Figura 4. Efectos del pH de la fase móvil acuosa sobre el tiempo de retención, la forma de los picos y la intensidad de los picos de determinados AMG en una columna Atlantis Premier BEH Z-HILIC.

1.3 Efectos de la concentración del tampón

La Figura 5 muestra los efectos de la concentración del tampón de la fase móvil acuosa (formiato de amonio) sobre la separación de determinados AMG en una columna Atlantis Premier BEH Z-HILIC (2,1 × 150 mm, 2,5 µm), utilizando un flujo de 0,7 mL/minuto y una temperatura de columna de 50 °C. La fase móvil A fue una solución acuosa de formiato de amonio a diferentes concentraciones (5 mM, 10 mM, 20 mM y 40 mM) con pH 3,0, mientras que la fase móvil B fue acetonitrilo con 0,1 % de FA. El programa de elución fue el mismo que el mostrado en la sección Experimental. La mejor intensidad de los picos se obtuvo con una concentración de tampón de 20 mM.

Figura 5. Efectos de la concentración de formiato de amonio en la fase móvil acuosa (pH 3,0) sobre la intensidad y resolución de los picos de determinados AMG en una columna Atlantis Premier BEH Z-HILIC.

1.4 Otros factores

Otros factores, como la temperatura de la columna y la concentración de FA en la fase móvil B, tienen una influencia limitada sobre la intensidad de los picos, la forma de los picos y la resolución cromatográfica.

Las columnas Atlantis Premier BEH Z-HILIC con diferentes tamaños de partícula (1,7 µm y 2,5 µm) mostraron las mismas tendencias bajo diversas condiciones cromatográficas, incluyendo composición, pH y concentración del tampón.

Se encontró que la columna con partículas de 2,5 µm (2,1 × 150 mm) permite utilizar un flujo mayor (0,7 mL/minuto) que la columna con partículas de 1,7 µm (2,1 × 100 mm) bajo el gradiente correspondiente (0,2 mL/minuto), lo que ayuda a reducir el tiempo de análisis.

La columna de 2,5 µm (2,1 × 150 mm) fue utilizada en el método final optimizado.

2. Selectividad del análisis

Se detectó un pico de interferencia proveniente de muestras de músculo blanco para SPC.

Inicialmente se utilizaron las transiciones MRM 351>98 y 351>207, que también habían sido utilizadas en otros estudios.9 Sin embargo, en este estudio se observó un pico desconocido en las muestras de músculo blanco a un RT de 1,62 minutos, que se superponía con el pico de SPC (RT de 1,56 minutos).

La relación de iones de este pico desconocido también era diferente de la correspondiente a SPC.

Para evitar una posible interferencia de este pico desconocido, se utilizaron transiciones MRM alternativas para SPC (351>333 y 333>140), y no se detectó ningún pico de interferencia proveniente de las muestras blanco.

Además, también se optimizaron las transiciones MRM de DSTP para reducir la interferencia causada por STP isotópicamente sustituida.

STP (peso molecular de 581 Da) y DSTP (peso molecular de 583 Da) tienen estructuras químicas similares y comparten el mismo patrón de fragmentación.

STP presenta un pico isotópico con la misma masa que DSTP, con una abundancia relativa del 5,8 % respecto a su pico mono-isotópico a 581 m/z. Esto puede interferir con la cuantificación de DSTP.

Se utilizaron transiciones MRM alternativas para DSTP que involucran sus aductos protonados isotópicamente sustituidos (MRM 585>263 y 586>247). Estas transiciones reducen la interferencia de STP sobre DSTP a menos del 1 %, manteniendo al mismo tiempo una sensibilidad adecuada para DSTP.

Es difícil eliminar completamente la interferencia provocada por las especies isotópicas de STP.

3. Efectos de la matriz

La Figura 6 muestra los efectos de matriz en el análisis de AMG mediante LC-MS/MS. Los efectos de matriz se evaluaron mediante la relación del área de pico entre extractos de muestras blanco adicionados a 1000 µg/kg después de la limpieza mediante SPE y estándares preparados en la solución de elución de SPE a 1000 µg/kg. Se observaron diferentes niveles de efectos de matriz para estos AMG, desde una fuerte supresión de la ionización, con relaciones tan bajas como inferiores al 20 %, hasta una fuerte mejora de la ionización, con relaciones superiores al 170 %. Por lo tanto, se requiere una calibración con matriz para la cuantificación de AMG.

Figura 6. Efectos de matriz expresados como la relación del área de pico de muestras de alimentos blanco adicionadas a 1000 µg/kg después de la limpieza mediante SPE frente al estándar en solución de elución de SPE a 1000 µg/kg. Las barras de error representan ±DE (n=4).

4. Recuperación mediante SPE

Las recuperaciones se calcularon mediante la relación del área de pico de muestras blanco adicionadas al inicio de la preparación de la muestra frente a muestras blanco adicionadas después de la limpieza mediante SPE (consulte la Figura 7). El nivel de adición fue de 1000 µg/kg. Las recuperaciones para la mayoría de los AMG, excepto KAS, en las cinco muestras —miel, leche, carne de res, carne de cerdo e hígado— estuvieron aproximadamente entre 40 % y 100 %, lo cual es comparable con los resultados reportados en matrices alimentarias similares.7,9 Se observó una baja recuperación para KAS. Esto está relacionado con su bajo valor de pKa (pKa1 de 3,23) en comparación con otros AMG, cuyos valores de pKa son aproximadamente de 7 o superiores. KAS se encuentra en su forma ionizada en la solución de carga de SPE, cuyo pH se ajustó a 6,75 ± 0,25, y no es retenida por los sorbentes Oasis HLB.

Figura 7. Recuperaciones de AMG en muestras blanco adicionadas a 1000 µg/kg y extraídas y limpiadas utilizando un cartucho Oasis HLB. Las barras de error representan ±DE (n=6).

5. Características de desempeño del método LC-MS/MS

El método LC-MS/MS optimizado se evaluó utilizando muestras de leche, carne de res, hígado y miel. Los límites de cuantificación (LOQ), el coeficiente de determinación (R²), los rangos lineales, el tiempo de retención (RT) y la precisión del RT para cada matriz alimentaria se presentan en la Tabla 3. Los valores de LOQ se estimaron utilizando muestras blanco adicionadas después de la SPE (post-SPE) a bajas concentraciones, en las cuales las relaciones señal/ruido (S/N) eran de al menos 10, o utilizando las concentraciones más bajas de las curvas de calibración, lo que fuera mayor. Los valores de LOQ obtenidos en estos alimentos se encuentran muy por debajo de los LMR establecidos en los principales mercados, como se muestra en la Tabla 1. Los valores de R² se obtuvieron a partir de estándares con calibración en matriz, adicionados después de la SPE, utilizando entre 4 y 6 niveles de concentración. Se obtuvo una excelente linealidad (R² > 0,99) en la mayoría de las matrices alimentarias. Las desviaciones estándar relativas (RSD) del RT se obtuvieron a partir de estándares en solvente, estándares con calibración en matriz y muestras adicionadas (n=57, precisión dentro del mismo día). Se demostró una excelente repetibilidad del RT para todos los AMG, con RSD inferiores al 1,0 %. La Figura 8 muestra una superposición de los cromatogramas de 17 AMG en una muestra de leche blanco adicionada a 2500 µg/kg. El factor de capacidad (k’) del primer pico en eluir (KAS) fue de 2,6. La exactitud del método se evaluó mediante el análisis de muestras blanco de miel, leche, carne de res, carne de cerdo e hígado adicionadas a un nivel de 200 µg/kg. La exactitud se calculó como la relación entre la concentración determinada y la concentración adicionada (Figura 9).

AMI se utilizó como estándar interno. Las muestras blanco adicionadas a un nivel de 1000 µg/kg se utilizaron como calibrante en las matrices correspondientes, mediante una calibración de un solo punto. También se muestran en la Figura 9 la exactitud promedio de cinco muestras para cada AMG y la desviación estándar (DE) de la recuperación. Las exactitudes medias oscilaron entre 86 % y 122 %, con DE entre 4 % y 23 %. Estos resultados son consistentes con los reportados para matrices alimentarias similares.7,9 Se analizaron 8 muestras de alimentos. No se detectó ningún AMG en estas muestras.

Tabla 3. Características de desempeño del método LC-MS/MS para muestras de leche, carne de res, hígado y miel.

Figura 8. Superposición de los cromatogramas de 17 aminoglucósidos en una muestra de leche blanco adicionada a 2500 µg/kg, obtenida bajo las condiciones finales optimizadas.

Figura 9. Exactitud en la determinación de AMG en muestras blanco adicionadas a 200 µg/kg utilizando una calibración de un solo punto y un estándar interno (AMI). (n=2; las barras de error representan la desviación respecto al valor medio).

6. Discusión

Los AMG presentan estructuras similares y su separación es difícil. La columna Atlantis Premier BEH Z-HILIC proporciona una buena resolución para 17 AMG bajo las condiciones cromatográficas optimizadas, que incluyen una fase móvil acuosa con formiato de amonio 20 mM a pH 3,0. Otras fases estacionarias de sulfoalquilbetaína requieren concentraciones de tampón mucho mayores, de hasta 175 mM de formiato de amonio,9 lo cual no es una condición adecuada para la detección mediante MS. Se desconoce la razón de la diferencia en la concentración óptima de tampón, pero se considera que podría estar relacionada con las partículas BEH, que presentan una menor actividad de los grupos silanol en comparación con las partículas de sílice. KAS no se incluyó en el método final debido a que no fue retenida adecuadamente durante la SPE. Sin embargo, podría analizarse directamente utilizando el extracto antes de la etapa de limpieza mediante SPE.

Conclusión

Se investigaron sistemáticamente los efectos de las condiciones cromatográficas, incluida la composición de la fase móvil, la concentración del tampón y el pH, sobre la separación de AMG en la columna Atlantis Premier BEH Z-HILIC. A diferencia de otras fases estacionarias zwitteriónicas de sulfoalquilbetaína, que requieren concentraciones elevadas de formiato de amonio de hasta 175 mM, la columna Atlantis Premier BEH Z-HILIC logra una separación adecuada y una excelente sensibilidad para 17 AMG comunes mediante una elución en gradiente con formiato de amonio acuoso 20 mM a pH 3,0 y acetonitrilo con 0,1 % de FA, en un tiempo de análisis de 10 minutos. El cartucho Oasis HLB SPE proporcionó una limpieza y recuperaciones satisfactorias para 16 AMG. El método LC-MS/MS optimizado, basado en la columna Atlantis Premier BEH Z-HILIC y el cartucho Oasis HLB, se evaluó utilizando muestras de leche, músculo, hígado y miel. Se obtuvieron una excelente sensibilidad, buena exactitud y buena precisión. Esto demuestra que este método HILIC-MS/MS proporciona una solución adecuada para el tamizaje y la cuantificación de AMG en alimentos.

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